Science：再立新功的巴斯德方案

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日前，一项合理的再创造免疫技术在预防疟疾（malaria）方面取得了给人印象极为深刻的好结果。

疟疾是一种感染性疾病，而且在青少年人群中是致死率最高的一种疾病。每年在非洲地区有80%的青少年死于疟疾，死亡人数接近100万。虽然近年来疟疾的致死率有所下降，但我们还需要开展更多工作来挽救这些孩子的生命。Seder最近报道了一种通过静脉接种的（intravenously）减毒疟原虫新疫苗，该疫苗取得了非常好的预防效果，这让我们离真正的疟疾疫苗又近了一步。

疟疾是由寄生虫当中一种叫做疟原虫（Plasmodium）的原虫（protozoan）感染人体所导致的一种疾病。疟原虫通过按蚊（Anopheles mosquito）的叮咬在人际间传播。疟原虫子孢子（sporozoite）储存在蚊子的唾液腺里，在叮咬人体时通过唾液（saliva）进入人体的血液系统。然后这些子孢子会感染人体的肝脏细胞，并且在肝脏细胞当中增殖进而形成裂殖子（merozoite），然后裂殖子再度进入血液循环系统，感染红细胞。裂殖子在红细胞内继续增殖，形成更多的裂殖子，有一部分裂殖子也可以通过有性生殖的方式形成配子（gametocyte），这些配子进入蚊子体内之后即开始进入蚊体内发育期，如附图所示。

Science：再立新功的巴斯德方案

上图所示的就是疟原虫的整个生活史。大量经过辐照减毒的疟原虫子孢子由静脉进入人体之后可以起到非常好的保护效果。

从20世纪上半叶开始，科学家们就一直盼望着能有一款疫苗能够彻底终结疟疾这个人类的大敌。最开始大家都在尝试巴斯德（Pasteur）发明的细菌疫苗方法，即用灭活的细菌当做疫苗的方法。于是有人使用福尔马林（formalin）灭活的疟原虫子孢子当作疟疾疫苗，可是失败了。当时大家还不知道疟原虫的生活史包括肝内期，也不知道疟原虫的子孢子只有在有活力，而且数量众多的情况下才能够入侵肝脏细胞，刺激我们人体的免疫系统产生免疫反应。到了20世纪40年代，有人用灭活的裂殖子加上免疫佐剂制成了一种疟疾疫苗，并且在猴子的试验当中取得了成功。但是由于这种免疫佐剂的毒性太大，再加上很难获得足够数量的疟原虫裂殖子制备疫苗，所以这种方法最终也不了了之了。可是到了1967年，科学家们取得了一个重大的突破，他们从被疟原虫感染的蚊子体内（唾液腺）分离得到了疟原虫子孢子，然后用辐照（irradiated）的方法对子孢子进行了减毒处理制成了疫苗。在小鼠动物实验中发现，使用这种疫苗，即便不使用免疫佐剂也能取得不错的保护效果。人体实验的结果也很不错。由于子孢子和蚊子都是经过辐照处理的，所以试验小鼠和人类志愿者都没有感染上疟疾，但是免疫细胞在疫苗的刺激下还是产生了免疫反应，足以抵抗之后的感染。

虽然这种疫苗给我们带来了很大的希望，但是后面开发人体疫苗的工作却整整沉寂了30多年，这主要是因为很难获得足够多的疟原虫子孢子，再加上这段时间是克隆技术发展的黄金时间，所以大家都把主要的精力用到克隆表达疟原虫抗原的工作当中了，这就是所谓的亚单位疫苗。科学家们希望使用某一个疟原虫蛋白，再加上现代化的、低毒性的、安全的免疫佐剂制成一个有效的疫苗，就好像其它成功的感染性疾病疫苗一样。

实际上有一种叫做RTS,S的亚单位疫苗也取得了不错的预防保护效果，这是以一种恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）子孢子表面蛋白为抗原开发而成的疫苗，我们知道恶性疟原虫是感染率最高的一种疟原虫。RTS,S疫苗就是要刺激机体产生保护性抗体，在疟原虫被蚊子传入人体之后，进入肝细胞之前消灭它们。目前RTS,S疫苗正在非洲的多个国家里进行III期临床试验。不过试验发现，这种疫苗不论是有效率还是免疫保护效果的持续时间都不太让人满意，因为有效率只有30~50%，而保护时间也只有短短的几个月。不过无论如何，RTS,S疫苗也是目前所有正处于研发阶段之中的亚单位疟疾疫苗里表现最好的一款。RTS,S疫苗和其它一些单一抗原疫苗都存在免疫原性不足的问题，或者会面临因为所使用抗原的多态性带来的问题，不论因为哪种原因，疟原虫都能够轻而易举地逃过疫苗诱发的免疫保护作用，所以这种疫苗的保护效果都不太好。

大约在10年以前，辐照减毒的子孢子及蚊子免疫方案又被人们重新摆上了桌面，但是这一次稍微做了一点小改动。这一次已经可以通过手工解剖的方式从蚊子的唾液腺里获得大量的子孢子，然后对其进行辐照减毒处理，将得到的子孢子疫苗冷冻保存起来备用。由于之前还从来没有在人体上用过这种疫苗。所以最初开展的试验主要围绕的都是安全性问题，即如何使用这种疫苗对人体才是最安全的。可结果发现，不论是皮内（intradermal）注射还是皮下（subcutaneous）注射方式都只能取得比较差的免疫保护效果，接种之后只有少部分人能够免于被疟原虫感染。但科学家们同时也对猴子进行了试验，只不过尝试了另外一种接种方式——静脉内接种。恶性疟原虫的子孢子也能够侵入猴子的肝细胞，但是这些子孢子进入肝脏，发育成裂殖子之后却不能像在人体内那样感染猴子的红细胞，也就不能完成疟原虫的整个生活史。所以这些试验猴不会发生血液感染，但是却可以让我们很好地研究疟原虫在肝内期时机体的免疫反应。出人意料的是，和皮下接种方式相比，静脉内接种方法得到了非常好的效果，从静脉内接种的猴子肝脏中取出的T细胞的反应活性要远远超过皮下接种的对照组T细胞。而T细胞免疫反应是大家公认的疟原虫肝内期免疫保护反应。

在这个猴子试验的基础之上，Seder等人制订了人体静脉内免疫接种计划。他们选择了6名志愿者，给他们接种了大剂量的辐照减毒子孢子疫苗，结果这6人全都获得了很好的免疫保护力。这一下子就使这种疫苗将其他的竞争对手远远地抛在了身后，使得后续的开发工作得以顺利进行下去。之后又减少了接种剂量，结果在9名志愿者当中也有6人获得了很好的免疫保护效果。接种剂量最高的人和免疫保护力最强的人体内的抗体滴度和CD4、CD8 T细胞反应强度也都是最高的。虽然这次试验的样本量还非常小，但是却发现与免疫保护力最有关系的CD8记忆T细胞（该细胞能够产生γ干扰素，这是抗寄生虫免疫作用的关键因子）反应与免疫保护效果呈现出了很强的相关性。这种全病原体疫苗诱发的超强免疫保护反应再一次印证了疟原虫疫苗的重要性及其合理性，因为疟原虫子孢子表达的1000多种蛋白都可以成为机体免疫反应攻击的潜在靶点。

虽然实验结果非常鼓舞人，但是这款疫苗如果要获得许可进行大面积推广还有很多问题需要解决。比如每接种一个人至少都需要60万个子孢子才能够获得比较好的免疫保护效果。可每一支蚊子体内至多只含有几万个子孢子。高通量的蚊子解剖技术可能会解决这个问题，另外更先进的冷冻保存技术也许能够改善冻存子孢子的免疫原性。此外，也可以通过其它方法解决子孢子无法复制的问题以及安全方面的问题，这也能够解决疫苗来源的问题。另外由于这种疫苗需要通过静脉内注射的方式进行接种，这也会带来一个患者依从性的问题。其他比较重要的问题还包括这种疫苗对于除恶性疟原虫之外的其它几种疟原虫是否也能够起到保护效果。从抗原的角度来看，两种没有亲缘关系的病原体应该是决然不同的。但是这种由整个子孢子构成的疫苗有一大优势，那就是含有全部的疟原虫蛋白，这就减少了单一蛋白质多态性所带来的问题。含有一个比较重要的问题就是免疫保护力持续时间的问题。因为在Seder等人开展的试验研究当中，在志愿者接种最后一次疫苗3周之后就进行了攻击试验。不过上述这些问题都是可以解决的，后续的研究工作也许进度能够更快一些。如果后续试验的结果也非常好，那么在不久的将来，将会有一款新的疟疾疫苗上市，在一定的范围内供大家使用。

原文检索：

Michael F. Good. Pasteur Approach to a Malaria Vaccine May Take the Lead. Science, 20 September 2013; DOI: 10.1126/science.1244157