大有可为的​​Cas9技术

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CRISPR/Cas 是目前最热门的基因组编辑工具。今年以来，国内外多个研究小组聚焦这一领域，在《Science》、《Nature》和《Cell》等杂志上发表多项重要成果，而生物技术公司也迅速推出相关产品。

CRISPR/Cas 系统经过改造，可实现多个哺乳动物系统内高效可靠的 RNA 导向基因组修饰，从而大幅提高了基因组编辑以及基因组调控的方便程度。在新一期的《Nature Methods》杂志上，来自哈佛大学的著名科学家 George M Church 与同事发表文章，详细介绍了 Cas9 靶定方法、目前的改造进展，并就未来临床上的潜在应用提出建议。

CRISPR/Cas 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源 DNA。CRISPR/Cas 系统通过将入侵噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。

此系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。

作者认为，作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是目前已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 RNA 可连接到sgRNA 的末端，不影响 Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。

例如，转录主要依靠调控复合物的组装及其与染色质的相互作用。让无核酸酶的 Cas9 靶定某些转录因子的结合位点，也许能阻碍这些因子的招募，从而阐明其在转录中的作用。因此，作者认为，Cas9 将作为一种灵活的工具，应用在多个方面，包括转录激活、转录抑制、表观遗传标记的调节、基因组结构的调节、sgRNA 表达和定位的控制、基因组编辑等。

作者还展望了 Cas9 的治疗前景。Cas9 介导的治疗干预可能有两条路线。第一是通过基因组编辑来纠正遗传病，并破坏入侵病毒的基因组。第二则是利用无核酸酶的 Cas9 融合，以类似于小分子药物的方式带来靶向的基因组调控。当然，这还需要跨过多个技术障碍。（生物通 薄荷）

原文检索：

Prashant Mali,Kevin M Esvelt& George M Church. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods, 27 September 2013; doi:10.1038/nmeth.2649