JBC：解析RNA去甲基化酶晶体结构

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JBC：解析RNA去甲基化酶晶体结构

2014年3月10日，在百年老牌杂志《生物化学杂志》（Journal of Biological Chemistry）发表的一项最新研究中，中国农业大学、清华大学和多伦多大学的研究人员，报道了RNA去甲基化酶Alkbh5催化核心的5个高分辨率晶体结构。该研究的通讯作者为中国农业大学的陈忠周教授和清华大学的成昌梅博士，合作者包括加拿大多伦多大学Yufeng Tong教授。该课题受国家基础研究973项目和国家自然科学基金等资助。
6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）是哺乳动物mRNA中最普遍和含量最丰富的一种RNA甲基化形式，也曾在植物和病毒的RNA中被发现过，其甲基化由SAM类甲基化转移酶催化而成。m6A是mRNA中存在的主要甲基化形式，可参与mRNA剪接、运输等加工过程，在基因表达调控中发挥重要的作用。m6A修饰主要以一种非化学计量的方式，发生在共有序列内，每个mRNA分子上只观察到5个m6A位点。m6A位点富集在终止密码子附近和mRNA的3’非翻译区，类似于DNA和蛋白质修饰，m6A甲基化是可逆的，可在时间和空间上通过甲基转移酶和脱甲基酶调控。近年来，对于m6A修饰的科学兴趣越来越多。
Alkbh5属于非血红素铁（II）/α-KG-dependent双加氧酶的保守AlkB家族。大肠杆菌AlkB已被证明能够修复DNA和RNA中的3-meC、1-meA、3-meT、1-meG和其他损伤。人类基因组编码9个AlkB同系物（Alkbh1–8和FTO）：Alkbh1是一种线粒体蛋白，可将RNA和DNA中的3-meC去甲基化，Alkbh2和Alkbh3有与AlkB相同的修复活性，但是Alkbh3和AlkB更喜欢ssDNA和ssRNA底物，而Alkbh2更喜欢dsDNA底物。Alkbh8能够催化tRNA中超级修改的摆动尿苷羟基化，这与膀胱癌侵袭相关。FTO最初被证实能够去甲基化合成的ssDNA和ssRNA中的3-甲基胸腺嘧啶和3-胸腺嘧啶。结构研究证实，FTO可选择地禁止双链核酸。此外，最近有报道指出，FTo对m6A表现出较高的去甲基化活性，证实ssRNA含有的m6A是这种酶的优先底物。
Alkbh5是缺氧诱导因子1（HIF-1）的直接转录目标，通过一系列细胞类型的缺氧诱导。Alkbh5的表达可以由PRMT7负调控。一项蛋白质组学研究表明，Alkbh5会优先结合编码序列的远端5’区。虽然多年来，我们已经认识Alkbh5，但是这种酶的底物和作用一直难以捉摸。
2013年，杨运桂和何川在《Molecular Cell》发表论文指出，Alkbh5是第二个哺乳动物RNA脱甲基酶，能够在体外和体内去除m6A的修饰。这项研究从生化、基因组学、细胞及模式生物多层次水平上，发现和鉴定了第二个m6A去甲基化酶与FTO同属加双酶AlkB家族的ALKBH5，进一步证实了可逆m6A甲基化调控mRNA表达水平和RNA代谢过程；ALKBH5敲除小鼠生精小管细胞中mRNA的m6A甲基化水平升高，同时引起睾丸萎缩，精子数量减少，质量下降，生育率下降等病变，证实ALKBH5介导的RNA m6A去甲基化调控精子发育等重要生理功能。在今年1月份，何川又发表了mRNA化学修饰的最新进展：何川教授Nature发布表观遗传学重要发现。
鉴于Alkbh5作为m6A RNA脱甲基酶的显著生物学作用，阐明Alkbh5脱甲基活性的分子机制，引起了相当大的科学兴趣。为此，在这项研究中，研究人员报道了Alkbh5催化核心的5个高分辨率晶体结构。他们发现，相比较其他AlkB蛋白，Alkbh5在这个家族典型的保守双链β螺旋顶部，显示出几个独特的结构特性。
在这些独特的特征当中，Alkbh5一个截然不同的盖区，在底物识别和催化过程中起着重要的作用。在Cys230和Cys267之间结合的一个意想不到的二硫键，通过给中央β折叠带来一个翻转域，是Alkbh5与单链RNA/DNA选择性结合的关键。研究人员根据几个结构引导的定点突变的脱甲基活性检测，制备了一个Alkbh5底物结合模型。使用各种α-酮戊二酸（α-KG）类似物进行了晶体学和生化研究，结果表明，Alkbh5的活性部位腔比FTO的小得多，并优先结合小分子抑制剂。
总而言之，这些研究结果为理解Alkbh5的底物识别特异性，提供了结构基础，并为抗AlkB家族成员的选择性药物设计提供了依据。