新一代测序技术在临床诊断中的应用

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一、基本情况

2005年，世界上首台新一代测序仪问世，并且很快就被应用到了如火如荼的医药领域当中。不论应用于何种疾病，新一代测序技术都能够在个性化医疗（personalized medicine）领域占据一席之地，因为可以根据每个人的基因组将患有相同，或者不同疾病的患者分成不同的种类。由于制药公司也开始转变策略，从过去热衷于开发“重磅炸弹”式 的药物（blockbuster drugs，寓指市场反响强烈、利润很高的拳头产品）逐渐转向开发靶向治疗药物（targeted therapeutics），而且这些靶向药物的用药基础正是患者之间的基因组及分子差异（变异），所以开发一种简便、快捷、准确，同时成本又不太高的测序诊断技术就显得尤为重要。

1. 第一代测序技术

20世纪70年代，分别由Fredrick Sanger和Walter Gilbert领导的这两个课题组一直在暗中较劲，他们都发表了详细介绍当时尚处于起步阶段的第一代测序技术的文章。 Gilbert的方案是所谓的化学降解法，即先对DNA链进行化学修饰，然后对放射性标记的DNA末端进行切割，再进行凝胶电泳，最后通过放射自显影的方法来读取DNA序列。Sanger的策略则完全不同，他的方法是所谓的链终止法（chain termination technique），他使用的双脱氧核糖核酸（dideoxynucleotides）能够使延伸中的DNA链终止延伸，从而得到DNA序列信息。由于Sanger测序法用荧光标记的引物取代了Gilbert测序法里的放射性引物，同时用毛细管电泳取代了凝胶电泳，所以Sanger测序法逐渐成为了科学研究和临床实验室里首选的测序金标准技术。耗时长达 13年之久，总计花费27亿美元的人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）也是依靠Sanger测序法才得以最终完成的。不过 Sanger测序法因为测序的通量太低，同时价格又太高，所以不适于分析复杂的二倍体基因组序列。于是科学家们又开始着手开发新一代测序技术。

2. 当今的测序技术

新一代测序技术在临床诊断中的应用

目前，新一代测序仪市场主要由以下这3家公司把持，他们分别是生命科技公司（Life Technologies）、Illumina公司和罗氏公司（Roche）。这些新一代测序技术和Sanger测序技术最大的区别在于能够进行大规模的平行测序（massively parallel sequencing），所以测序的时间和费用都有了极大的降低，并且能够获得数十亿条序列信息（sequence reads）。在这些公司生产的新一代测序仪里，每一种化学标记技术都是独家专利，不过基本的原理都是非常简单的，即在DNA PCR扩增时，借助这些化学标志物在碱基插入 DNA链时发出的信号来读取序列信息，这些信号可以是光信号，也可以是H+流信号（H ion fluxes）。SOLiD、HiSeq、GS FLX等最初级的新一代测序仪主要偏向的都是科研应用领域，可以在数天的时间内获得大量的DNA序列数据。不过这个速度还是不能满足临床应用的需求，在临床工作中需要速度更快的测序仪，同时也需要体积更小巧一点的测序仪，所以各大测序仪生产厂家又相继推出了新产品，比如生命科技公司基于离子流技术开发的Ion Torrent PGM测序仪，Illumina公司的 MiSeq，和罗氏公司的GS Junior等。这些新产品让新一代测序仪走进了临床，成为了在临床诊断实验室里常见的设备。

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二、新一代测序技术的临床应用

自2010年以来，使用新一代测序仪的临床试验数量有大幅度的增加（表2）。这些临床试验开展的测序工作无所不包，有全基因组测序，也有全外显子组测序，还有RNA测序和定向测序（targeted sequencing）。不论采取哪种测序方式，所有这些临床试验都是为了发现致病的遗传异常，并且根据这些异常信息来指导临床诊疗工作。与此同时，这些信息也有助于生物制药企业开发出更多的靶向治疗药物，也可以帮助他们了解某些药物产生耐药性的原因。

表1使用新一代测序仪作为主要检测手段的肿瘤研究项目一览表

研究项目         项目赞助人         国际临床试验注册NCT号         项目开始时间         研究疾病         项目简介         采用的测序技术
血浆乳腺癌特异性DNA检测项目         Dartmouth-Hitchcock医学中心（Dartmouth-Hitchcock Medical Center）         NCT01617915/6         2012年10月         乳腺癌         分析乳腺癌细胞内的染色体重排和基因组异常情况         全基因组测序
唐氏综合症及急性髓细胞样白血病全外显子组测序研究项目          儿童癌症组织(Children’s Oncology Group)         NCT01507441/10         2012年2月         白血病         对白血病和唐氏综合症患儿的DNA标本进行检测，发现其中的异常情况         全外显子组测序
研究儿童肾上腺皮质肿瘤患者标本里的基因         儿童癌症组织(Children’s  Oncology  Group)         NCT01528956/10/         2012年2月         肾上腺皮质肿瘤         对肾上腺皮质肿瘤患者的基因进行研究         全基因组测序
开展定向测序及全基因组测序临床研究的可行性探讨         多伦多大学的教学医院联盟(University  Health  Network, Toronto)         NCT01345513/150/          2011年3月         实体瘤         发现癌症患者体内的突变基因         全基因组测序
利用全基因组测序技术对晚期癌症患者进行的辅助性中试         美国斯科特斯戴尔医护中心(Scottsdale Healthcare)         NCT01443390/10/         2011年9月         晚期癌症         对使用了尚处于临床试验1期阶段的抗癌药物的肿瘤患者进行调查，了解其疗效         全基因组测序
癌症基因组分析项目         韩国首尔国立大学医院（Seoul National University Hospital）         NCT01458604/100/          2011年8月         恶性肿瘤         发现与药物相关的遗传变异，并对其进行分析         定向测序、全外显子组测序以及RNA测序
在急性髓细胞样白血病婴儿患者的组织标本中寻找RNA生物标志物         儿童癌症组织（Children’s Oncology Group）         NCT01229124/20/         2010年10月         白血病         分析患者的组织样品，寻找新的RNA生物标志物         RNA测序
对实体瘤进行分子学分析          圣裘德儿童研究医院（St. Jude Children’s  Research Hospital）         NCT01050296/360/          2010年1月         儿科实体瘤         分析肿瘤的基因表达谱，寻找遗传突变         全基因组测序
对乳腺癌的转录组（Transcriptome）进行深度测序         美国阿肯色大学（University of Arkansas）         NCT01141530/30/         2009年9月         乳腺癌         研究雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）及人表皮生长因子受体2（HER-2）三阴性乳腺癌的转录组调控情况         RNA测序

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1. 肿瘤分子诊断领域

新一代测序技术（ NGS）已经走进了临床，在很多临床应用领域里占据了一席之地，尤其是在肿瘤分子诊断领域（cancer molecular diagnostics）更是当仁不让的主力军，因为临床医生们需要根据患者的个体基因组信息对他们进行区分，实施个性化诊疗工作。随着诸如专门针对 EGFR突变阳性肺腺癌患者的Tarceva等靶向治疗药物的诞生，临床上也依托免疫组化（immunohistochemistry）、DNA芯片（DNA microarray）、或者RT-PCR等技术相应地开展了一系列单基因检测项目（single gene tests）。随着我们对肿瘤基因组认识的不断加深，随着大量的靶向抗癌药物进入临床试验，我们相信，未来肿瘤科医生一定会有更多、更有效的手段来对抗肿瘤。由于肿瘤基因组测序会得到肿瘤细胞基因组中的绝大部分序列，其中还包括转位（translocations）等多种突变信息，所以利用新一代测序仪也可以开展预后评估和疗效预测等方面的工作，帮助临床医生为每一位患者挑选出最合适的治疗方案。

比如通过全基因组测序就在一位急性髓细胞样白血病（acute myeloid leukemia）患者的基因组中发现了一种新的插入融合突变（insertional fusion），即经典的bcr3 PML­RARA融合基因（bcr3 PML-RARA fusion gene），也正是因为这一发现，这位患者的主治医生才为他重新设计了一套治疗方案。通过对癌症患者进行全基因组测序，临床医生们可以根据检测结果设计出专属于这位患者自己的特异性探针，有了这对探针，医生们就可以监测患者的治疗效果，了解病情是否有复发，而所需的只是患者的一点血液而已。随着科研工作的不断发展，将来肯定会发现更多的生物标志物（biomarker），开发出更多的靶向治疗药物，这都会丰富临床医生的诊疗手段，让他们为每一位患者都制定出最合适的诊疗方案。

目前欧洲学界普遍认为，NGS取代桑格测序技术（Sanger sequencing）进行BRCA检测是未来市场的趋势。它的优势在于较低的测序成本、快速的Turnaround时间、简单的实验操作和后期的数据分析。BRCA是Breast Cancer Susceptibility Gene的缩写。BRCA

基因变异最早被发现与女性的乳腺癌和卵巢癌发病有密切的关系。BRCA1和BRCA2属于抑癌基因，叫乳腺/卵巢肿瘤感基因。正常细胞中，BRCA1和BRCA2可以帮助DNA损伤修复和维护DNA完整，防止癌细胞的产生。如果 BRCA1/2产生基因变异，失去了这一保护，细胞产生癌变的几率大大增加。而BRCA2基因变异与男性的乳腺癌，胰腺癌和前列腺癌有密切关系。前段时间著名影星Angelina Jolie自爆已接受预防性双侧乳腺切除术，因为她本人罹患乳腺癌的风险极高。38岁的美国女星Angelina Jolie在《纽约时报》上发表了《我的医疗选择》一文，称由于自己携带有 BRCA1基因，医生估计她患上乳腺癌的风险高达87%，患上卵巢癌的风险高达50%，她母亲在56岁时死于癌症。朱莉说切除术后，她患上乳腺癌的风险已降至5%。日后，有与安吉丽娜•朱莉同样担忧的女性就可以借助 NGS技术进行BRCA检测，提早采取相关措施。

2. 遗传病筛查领域

新一代测序技术对于新生儿孟德尔式遗传病筛查项目（screening of newborns for Mendelian disorders孟德尔遗传病）也很有帮助。临床医生们通常都会根据表型与基因型的关系（phenotype -genotype correlations）进行单基因遗传检测，以此来明确诊断。不过孟德尔式遗传病也能够以非常复杂的形式存在，同一种表型可能是由多个基因来决定的，其中就有可能存在目前尚未被发现的基因。在这种情况下单基因检测就显得无能为力了，可新一代测序技术解决起这种问题来却毫不费力，能够以极快的速度搞定这一切。最近儿童慈善医院（Children's Mercy Hospital）就成功地在50个小时内确诊了592种罕见的儿童疾病，这个活生生的例子生动地展示出了新一代测序仪在临床应用工作中的巨大潜力。

3. 产前诊断领域

在产前诊断方面（ prenatal diagnosis），以新一代测序技术为依托的创新检测手段也将会彻底改变传统的诊疗模式。 Sequenom公司的分子医学中心（Center forMolecular Medicine）目前就推出了一种名为 MaterniT21的产前诊断项目，这是一种非侵入式的产前检测手段（non invasive prenatal test），能够诊断21三体综合症（trisomy 21）。只需要抽取孕妇一点点血液，检测其中微量的胎儿21号染色体就够了。这种非侵入式的产前检测手段，以及类似的检测13三体或者18三体综合症的检测手段都具有非常高的敏感度和特异性，一定能够在产前检查领域里找到自己的位置。

另外，最近由Y.M. Dennis Lo和 Stephen Quake领导的研究小组利用新一代测序技术检测到了胎儿染色体的非整倍体（chromosomal aneuploidy）情况。之前的工作已经发现，在孕妇的血液当中含有胎儿的核酸DNA和RNA（非细胞内的游离核酸），同时也含有母体自身的游离核酸分子（非细胞内的核酸）。科学家们开发出了多项使用这种游离的核酸分子进行分析和研究的技术，比如对胎盘中的目标染色体（比如21号染色体）来源的mRNA进行检测，又或者用数字PCR分析技术（digital PCR analysis）对大量的目标染色体位点进行相对定量检测（与参考染色体位点对比）等，用这类技术可以确定胎儿是否存在非整倍体畸形的情况。

基于染色体相对定量的概念， Lo和 Quake的团队分别发现可以将母体血液里分离得到的游离 DNA转化成 Illumina文库（Illumina library），然后进行测序，最后将测序结果与人类参考基因组比对，确定这些序列在人类参考基因组中的位置。通过计算测出每一条染色体上的序列数量，可以得到每一条染色体的相对定量结果。如果胎儿真的存在非整倍体的情况，那么测得的结果就会明显的超出正常值。这项技术的准确性已经在检测21三倍体的产前诊断工作中得到了验证，在检测 18三倍体和13三倍体的产前诊断工作中也取得了很好的成绩。这些研究工作预示着一种新的胎儿非整倍体检测技术正式诞生，也为在病理和非病理情况下用新一代测序技术对细胞外的游离DNA进行检测和分析提供了坚实的试验依据。

4. 感染性疾病和公共卫生监测领域

新一代测序技术还可以用于感染性疾病和公共卫生监测（infectious disease and public health surveillance）等领域。最近，美国国立健康研究院（NIH）公布了一项研究结果，汇报了他们在跟踪一次爆发疾病传播时使用实时测序（real time sequencing）技术的情况。2011年，中欧爆发了一次致命性的出血性肠道感染（hemorrhagic intestinal infection），当时NIH就使用生命科技公司的 Ion PGM测序仪快速地找到了致病元凶——一种致死性的大肠杆菌（E. coli）。在医疗机构里，也可以使用新一代测序技术来跟踪耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA（即所谓的超级细菌）的传播情况，目前英国正有科研人员使用新一代测序技术为所有的MRSA菌株编辑、整理一个数据库。

新一代测序技术能够让科研人员发现肿瘤基因组里的突变，还可以应用于产前诊断（prenatal diagnostics）、病原体检测（pathogen detection），以及遗传突变（genetic mutations）筛查等。虽然在临床工作中早已经采用Sanger测序、PCR、基因芯片等技术来检测遗传突变，但是这些方法都有各自的局限性，其检测能力远远不及新一代测序仪。比如，虽然基因芯片可以检测出单碱基突变（single nucleotide variants, SNV），但是却不能够发现大规模的DNA异常，例如大范围的碱基缺失，或者DNA结构异常等突变，可是在肿瘤基因组中这些突变都是非常常见的。相比之下，全外显子组测序（whole exome sequencing）和全基因组测序（whole genome sequencing）能够准确地、全面地发现基因组中的各种DNA异常、遗传重组突变和其它各种突变。由此可见，新一代测序技术是一种非常好的诊断技术，同时也是很有用的预后预测技术，能够帮助临床医生们准确地判定出每一位患者的特点，为个性化医疗的顺利开展铺平道路。

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三、小结

与任何一种检测手段走入临床一样，最开始，新一代测序仪在临床机构中的广泛应用速度是非常缓慢的，除非取得了重大的突破，在伦理、技术、结果解析以及管理等相关领域存在的各种问题都得到了很好的解决。其中最重要的一个问题就是如何分析、解读海量的测序结果，这也是相当费钱的一项工作。这就需要临床生物信息学家和受过专门训练的临床医生们能够慧眼识珠，从海量的测序结果当中挑选出最有意义、对疾病诊疗工作最有价值的测序结果。

除此之外，保险公司和卫生监管部门也都必须积极地参与进来，让他们确保采用新一代测序技术的检测项目都能够完成标称的检测内容，达到标称的检测目的。在这方面，包括美国疾病预防控制中心专门负责实验室检验标准的部门（Centers for Disease Control Division for Laboratory Science and Standards）以及美国病理学家学会（College of American Pathologists）在内的多个机构都已经行动起来，制定出了相关的管理细则，对测序检测项目的准确性、敏感性、特异性和可报告（应用）的范围等指标进行了定义和规范。这些工作还将明确有关新一代测序检测业务的具体赔偿事项。

原文检索：

1. Saunders CJ, et al. Rapid whole-genome sequencing for genetic disease diagnosis in neonatal intensive care units. Sci Transl Med 2012;4(154ra135).

2. http://www.sequenomcmm.com/Home/ ... y-21/About-the-Test

3. http://www.biologicalproceduresonline.com/content/15/1/4

4. Karl V. Voelkerding, Shale A. Dames, and Jacob D. Durtschi. (2009) Next-Generation Sequencing: From Basic Research to Diagnostics. Clinical Chemistry, 55(4): 641-658.