南京大学模式动物研究所黄行许课题组和英国Sanger研究所 Bill Skarnes 课题组开展国际合作，利用Cas9切口酶和成对sgRNA，能够高效突变小鼠基因，并且大大降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效应，《自然-方法》(Nature Methods)于3月2日在线发表了这一研究成果。 以《应用CRISPR-Cas9切口酶进行最小脱靶剂量的基因组改造》（Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects）为题的论文第一作者为南京大学沈彬、Sanger研究所张文胜博士和南京大学张军，Sanger研究所Bill Skarnes教授和南京大学黄行许教授是该论文的通讯作者。这是黄行许课题组继上个月在《Cell》上发表文章后再次在高影响力杂志上发表他们的研究成果。 CRISPR/Cas9系统虽然能够高效突变基因，但其脱靶效应妨碍进一步应用，特别是临床应用。为降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效应，研究小组通过改进CRISPR/Cas9系统，利用Cas9切口酶和成对sgRNA（如下图），通过注射小鼠受精卵，在不降低基因突变效率的前提下，可有效降低CRISPR/Cas9系统的在小鼠基因组上的脱靶效应。成对sgRNA的选择比较关键，两条sgRNA结合不同的DNA链，其PAM序列要以尾对尾（tail to tail）出现，并且两个sgRNA结合的位点不能相隔太远，Cas9切口酶会在每个sgRNA结合的地方造成小小的单链切口（SSB），两个相邻的单链切口会形成一个DNA双链断裂（DSB），DSB的形成会激起细胞以非同源末端链接（NHEJ）的方式进行修复，该过程中会引入插入、缺失或者突变（如下图）。而在潜在脱靶区域，单个sgRNA造成的SSB会通过碱基切除修复方式精确修复该区域，不会引入突变。该合作课题组通过该技术同时敲除三个小鼠基因（包括Rag1和Rag2），同时提供了免费的在线资源序列查询网站。研究结果说明这一方法可以应用于其他物种的基因组改造，并显示出临床基因治疗的应用前景。