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标题: iPS工具帮你逆转细胞的时钟 [打印本页]

作者: qwerzxcv2011 时间: 2014-1-13 09:29
标题: iPS工具帮你逆转细胞的时钟
iPS工具帮你逆转细胞的时钟

自山中伸弥诱导出第一个iPSC（诱导多能干细胞）以来，已经过去了七年。2012年，这一成果为他赢得了2012年的诺贝尔生理/医学奖。
人们一般通过诱导一些转录因子（最常用的是Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc或OKSM），将已分化的细胞转化为iPSC。这一技术已经渗透到了生命科学的各个领域，研究者们在此基础上寻找致病基因、进行药物研发和开发细胞疗法。现在，市面上已经有各种各样的工具，可以大大简化和促进iPS过程。
运载工具
山中伸弥最初是利用逆转录病毒载体，对细胞进行重编程。如今，商业化的逆转录病毒编程载体已经非常常见。 EMD Millipore公司的STEMCCA重编程试剂盒，采用慢病毒作为载体。慢病毒是逆转录病毒的一个亚类，也能够整合到宿主的基因组。该产品有多种形式可选，例如基础型或doxycycline诱导型，floxed或Cre剪切型。据该公司的产品经理Nick Asbrock介绍，即使是传统难以处理的细胞（如外周血细胞），STEMCCA重编程试剂盒也能够胜任。
“每个重编程试剂盒都有利有弊，”Asbrock说。“我们的试剂盒虽然属于基因组整合产品，但非常有效，重现性很好，而且可切割。”
最近，EMD Millipore公司还发布了可渗透进入细胞的Cre重组酶（TAT-Cre）。这种酶无需表达，可以直接添入细胞。该产品与floxed STEMCCA试剂盒配对使用，能为用户去除宿主基因组中的iPSC转基因，避免了额外的转染或病毒感染步骤。
一些研究者担心转基因会在宿主基因组引起意外改变，希望在重编程中避免基因的整合。此外，有些重编程因子可能致癌。如果要将细胞用于临床，基因整合肯定是不可行的。
Life Technologies公司的CytoTune®-iPS重编程试剂盒，利用仙台RNA病毒，可以做到“在细胞中不留痕迹，”该公司的Uma Lakshmipathy说。Life Technologies公司最近发布的新版CytoTune2.0试剂盒，大大提高了重编程效率，加快了病毒的清除。（Life Tech 2.0版细胞重编程试剂盒上市）据介绍，新版与旧版的主要区别在于，旧版试剂盒的各个因子位于不同的载体上，而新版试剂盒中Klf4、Oct4和Sox2的表达组件在一个载体上，c-Myc和Klf4在另一个载体上。
此外，Life Technologies公司还提供非病毒的DNA质粒载体，包括Episomal iPSC重编程载体（OKSM+Lin28+Nanog）和Epi5™ Episomal iPSC重编程试剂盒（OKSM+Lin28）。(Life Tech推出一系列干细胞新品)
Stemgent公司提供的重编程试剂，以合成的mRNA为基础。这一产品的优势在于，既不是病毒载体，也不整合到基因组，Stemgent公司的研发主管Brad Hamilton介绍到。但是，由于细胞无法保留这些RNA，需要通过转染反复将其引入细胞。不过，现在公司已经大大简化了这一过程。
Stemgent公司的新miRNA Booster技术，利用microRNA对mRNA的效果进行补充。这些microRNA能够上调多能性因子，下调分化性因子。这一技术大大简少了整个重编程系统所需的转染步骤。“我们以miRNA、Stemfect™RNA转染试剂盒、（BD）Matrigel™为基础，建立了新的重编程方案，能够减少日常工作量，降低转染次数，节约时间，生成无需整合的人类iPS细胞克隆。”
小分子可以帮你提高细胞重编程的效率，EMD Millipore公司、Stemgent公司、Tocris Bioscience公司都提供这样的产品。这些分子主要负责打开染色质，不过有时它们也能够替代特定的重编程因子。举例来说，Stemgent公司的Stemolecule™ ALK5 Inhibito就能够取代Sox2。
在通常情况下，细胞重编程至少需要一个转录因子。不过今年夏天，北京大学的研究人员首次展示，只需要七种小分子就可以生成小鼠的iPSC（他们将其称为CiPS），整个系统无需核酸参与。（北京大学邓宏魁教授Science突破性重编程技术）
培养基胚胎干细胞需要在特定的培养基上生长，iPSC也同样如此。
STEMCELL Technologies公司提供不少iPSC培养产品，包括一路畅销的mTeSR1™（无滋养层的多能干细胞维持体系），TeSR2™（无动物源蛋白的多能干细胞维持体系），以及更简单的无滋养层系统TeSR™-E8™。（STEMCELL新推成分确定的iPSC培养基） TeSR™-E7™是STEMCELL公司的iPSC重编程优化培养基。据该公司的产品经理Simon Hilcove介绍，与其他培养基相比，TeSR-E7所生成的细胞克隆更优质。也就是说，TeSR-E7得到的初级克隆更紧凑，边界更清晰，更容易进行鉴定、分离和扩增。“该产品能够减少细胞的分化和成纤维细胞的过度生长，真正简化人工选择过程，”他说。
Life Technologies公司的KnockOut™血清替代物，是有滋养层的iPSC生长系统，而该公司的Essential 8培养基™则属于无滋养层培养基。其他iPSC培养基还包括，EMD Millipore公司的PluriSTEM™生长培养基，Stemgent公司的NutriStem™ 生长培养基和Pluriton™重编程培养基。据Hamilton介绍，NutriStem和Pluriton高度兼容，能够有效地从细胞重编程过渡到细胞扩增。
EMD Millipore公司的PluriSTEM™生长培养基，以小分子为基础，其中的生长因子比较少，相对而言更加稳定，Asbrock说。与其他培养基相比，PluriSTEM™的使用者不用那么频繁的喂养细胞，从而降低成本。“周末还得要喂养细胞，这是令许多人头疼的事，而这款产品可以帮你省去这些麻烦的日常操作，”他说。
鉴定工具
据Hilcove介绍，人们一般通过两种途径鉴定自己得到的iPSC。一是染色体核型分析，用来检测染色体异常。二是细胞分化，验证iPSC是否能够形成所有三种胚层（外胚层、内胚层和中胚层）。传统上，人们利用小鼠畸胎瘤分析来确定细胞的分化能力，但近来研究者们越来越倾向于使用体外的细胞分化系统，例如STEMCELL Technologies公司的STEMdiff™系列产品。一旦细胞完成分化，人们就能够通过抗体或基因表达分析，检验各细胞胚层的标志物。
除了细胞的分化情况以外，研究者们也可以用抗体检验细胞的多能性。CST、EMD Millipore、Life Technologies、R&D Systems、 Rockland Immunochemicals、STEMCELL Technologies、Stemgent等商家纷纷推出了自己的抗体产品，针对细胞的多能性或分化性，靶标细胞表面或细胞内的各种标志物。这类产品形式多样，应用广泛，可用于流式细胞分析和免疫荧光分析。
CST公司的StemLight™ iPS细胞重编程抗体试剂盒，由未标记的抗体组成，靶标Oct4A、Sox2、Nanog、Lin28A、Klf4和c-Myc，用于评估重编程转录因子的表达。该公司的StemLight多能性抗体试剂盒，可以靶标转录因子（Nanog、Oct4A、Sox2），也能靶标细胞表面的标志物（SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81）。
Rockland公司也推出了一系列的iPSC靶标抗体。该公司计划于明年一月份，推出一个由十种抗体组成的产品，希望帮助用户通过免疫组化和免疫荧光，鉴定iPSC的多能性和分化情况。
不少研究者倾向于进行流式细胞分析，为此EMD Millipore公司将其流式抗体打包进FlowCellect™人类iPS细胞鉴定试剂盒。该试剂盒包括针对TRA-1-60、SSEA4和Oct4的抗体，以及靶标SSEA1的阴性对照抗体。此外，EMD Millipore公司的Milli-Mark™系列产品，专为流式细胞分析提供单独的抗体。
用于活细胞的iPSC检测工具，也受到了研究者们的青睐。例如，Life Technologies公司提供的活细胞染色试剂，能够通过碱性磷酸酶的活性，检测iPSC的诱导情况。R&D Systems推出了不含叠氮物的检测抗体，这些抗体直接连有标记，无须二抗即可成像iPSC克隆。R&D System的GloLIVE™抗体靶标SSEA1、SSEA4和TRA-1-60，据介绍该公司即将推出靶标TRA-1-81的检测抗体。类似产品还有，Stemgent公司的StainAlive™荧光标记抗体。
“这些抗体适用于活细胞，”Hamilton解释道。“在体外培养的细胞中，这些抗体可以帮助人们标记目标克隆。24-48小时后，抗体的信号会慢慢褪去。”
EMD Millipore公司的SmartFlare™试剂，能够在活细胞中，评估RNA（而非蛋白）的表达情况。据介绍，SmartFlare探针是连接着多个双链寡核苷酸序列的纳米金颗粒，其中的“报告链”带有荧光基团。当荧光基团靠近纳米金颗粒时，荧光淬灭。而当纳米金颗粒上的“捕获链”与目标RNA结合时，“报告链”被释放出来，其上的荧光基团发光。举例来说，人们可以利用这一产品，根据细胞内的RNA标志物进行细胞分选。据称，SmartFlare系列产品覆盖了许多重编程因子。
Life Technologies公司与哈佛大学的Alex Meissner合作，开发了TaqMan® hPSC Scorecard™ Panel。该产品能够检测93个关键基因的表达，这些基因与细胞的多能性和分化性有关。该产品还提供云端软件，人们可以将qPCR结果，与iPSC/ESC参考细胞系进行比较，为自己细胞的多能性打分。

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